手把手教您掌握钙黄绿素-钴淬灭法检测线粒体通透性转换孔
在细胞受到某些强效压力（如钙离子超载、剧烈氧化应激）时，线粒体内膜上的一个关键通道——线粒体通透性转换孔（MPTP）——会发生持续性开放。这相当于细胞能量工厂的“安全阀门”被卡在了打开状态，直接导致膜电位崩溃、能量生产中断和细胞功能发生不可逆转变。因此，检测MPTP的开放状态，是从机制上游评估线粒体膜完整性与功能的关键手段。
目前，基于钙黄绿素（Calcein AM）与氯化钴（CoCl₂）淬灭联合的流式细胞术方法被广泛采用。其原理精妙，可分为三步理解：
全细胞标记： 脂溶性的Calcein AM自由进入活细胞，被胞内酯酶水解为水溶性的、发强绿色荧光的Calcein分子，滞留在整个细胞内（包括胞浆和线粒体）。 胞浆荧光特异性淬灭： 加入Co²⁺（来自CoCl₂），它能进入胞浆并与Calcein结合，高效淬灭其荧光。由于正常关闭的MPTP和线粒体内膜屏障，Co²⁺无法进入线粒体基质，因此此时仅有线粒体内的Calcein保持绿色荧光。 诱导MPTP开放与观察： 随后加入MPTP诱导剂（如钙离子载体Ionomycin，诱导钙超载）。若MPTP被成功诱导开放，Co²⁺得以进入线粒体，淬灭其中的Calcein荧光，导致绿色荧光信号显著下降。荧光减弱程度直接反映了MPTP开放的程度。展开剩余44%实验操作关键要点与注意事项：
标准化与避光： 细胞培养、染色孵育时间与温度需严格保持一致，整个染色及检测过程需避光操作。 浓度优化： Calcein AM和CoCl₂的最佳工作浓度需根据不同细胞类型进行预实验优化，以达到清晰的特异性标记与淬灭效果。 对照设置至关重要： 必须设立明确的阴性对照（仅Calcein AM染色，整体强荧光）和阳性对照（Calcein AM + CoCl₂ + Ionomycin，线粒体荧光被淬灭），以验证实验体系的有效性。 流式设置： 使用FITC通道（或相应绿色荧光通道）检测Calcein荧光，并确保仪器校准。此方法侧重于评估线粒体膜通道的“通透性”功能状态，与JC-1等直接检测“电位”的方法形成有力互补，尤其适用于心肌缺血再灌注损伤、特定神经毒性、药物肝毒性等研究领域。亚科因生物（Abbkine） 推出的线粒体通透性转换孔（MPTP）检测试剂盒（货号KTA4002），将这一经典方法转化为经过系统优化的即用型试剂方案，并配有详细的操作视频与指南，助您精准捕获这一关键生物学事件。
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